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基因修饰小鼠｜聊聊显微操作技术
显微操作技术，是指在光学显微镜或解剖镜下，进行手术、解剖和注射等试验操作的技术。在模式动物和辅助生殖领域，常用的显微操作技术，包括：原核注射、胞质注射、8-cell注射、囊胚注射、四倍体胚胎注射、2-cell注射和胞质内单精注射（ICSI）等。这些技术的特点，是通过研究配子（精子、卵子和受精卵）、辅助细胞（卵巢或者睾丸支持细胞）和干细胞（多能性或全能性干细胞）等，在细胞或者亚细胞水平，阐明受精和胚胎发育的机制，提供更优的体外培养条件，或者更科学无害的产前诊断方案。
这些技术可以简单的归为三类：
（1）胚胎或配子移植或操作，如胚胎移植，体外受精（IVF），或者将DNA、RNA、蛋白、病毒、染料或其他体育材料的原核或者胞质注射等；
（2）亚细胞水平的移植，如细胞核移植，线粒体移植等；
（3）多能性细胞分化，转分化或者重组胚胎，如ES细胞诱导分化成胚胎等。
这些技术中多数已经商业化普及（如下表）。
原核注射技术
原核显微注射技术，将目的样品注入小鼠或大鼠的受精卵原核中，选择易于注射的原核，雌原核和雄原核均可，注射完毕后，将受精卵移植入假孕母鼠输卵管内，待仔鼠出生后，用PCR方法筛选整合外源基因的阳性仔鼠。完成该技术一般步骤，包括：
（1）卵细胞固定针和原核注射针的制作；
（2）操作盘的制作；
（3）在原核注射针中，用微量加样枪加入样品；
（4）调整好显微镜、操作臂和微量样品连续注射仪（如Fomtojet），将固定针和注射针固定在操作臂上，在操作盘中将针尖碰断成小于1μm的斜口，长按Clean键，排出针中可能存在的气泡；
（5）原核期胚胎放到操作盘中，开始原核注射，若针断口合适，1~2秒钟即可以看到原核膨胀，1个小时可以注射约100枚原核期胚胎。转基因的阳性率平均在3%左右，具体项目的成功率高低，与注射片段的大小紧密相关。
胞质注射技术
胞质注射技术，是在Crispr技术出现后兴起的注射技术，因为基因敲除（KO）的效率高，是制作基因敲除动物的首选。胞质注射技术，与原核注射基本类似，只是胞质可以容纳更大的体积，但看不到细胞的膨胀。一般原核注射，细胞核膨胀的体积在1~2pL，胞质中可以容纳10~1000倍的量。因而，除了用原核注射针注射，也可以选用Pizeo辅助的单精子注射针（ICSI）注射。胞质注射时，一定要确认注射针扎透了卵胞质膜，若没有穿过质膜，注射的液体会在质膜与针尖之间形成一个小液滴；遇到这种情况，需要重新注射。对于有DNA模板同源重组的基因敲入（KI）项目，也可以采用原核和胞质同时注射的方法。对于2-cell期的胚胎，也可以采用胞质或原核与胞质同时注射的方法。
囊胚注射、四倍体胚胎、8-cel注射技术
囊胚注射技术，是指将多能性的ES细胞，注射到处于扩张囊胚时期的囊胚腔中，移植到代孕小鼠输卵管，或者子宫中获得嵌合鼠的技术。若嵌合鼠可以种系传递，则可以将基因打靶修饰过的ES细胞，转变成活的基因编辑小鼠用于实验研究。该技术适宜于基因编辑效率低的基因修饰项目，在ES细胞水平筛选阳性克隆后（一个10cm 培养皿有1000万个细胞，通过抗性基因筛选富集阳性ES克隆，比同等数量的大小鼠胚胎的成本低多个数量级），再制作嵌合体大小鼠。
因为嵌合体存在不种系传递的风险，体育学家研发了2条制造ES小鼠的新途径：
（1）四倍体胚胎注射，在小鼠胚胎2-cell阶段，通过电熔合仪，将胚胎融合成1-cell，因融合后胚胎细胞中含有两套染色体，这个胚胎称为四倍体胚胎，发育到囊胚阶段后，可以进行ES细胞的囊胚注射。因为多倍体不能发育成胎儿本身，只有一部分参与胎盘的行程，有利于着床，因而获得的嵌合鼠均来源于ES细胞本身，称为ES小鼠。尽管该技术一步可以获得ES小鼠，但成功率低，特别是ES小鼠的异常率比较高（如大胎儿综合征、幼崽死亡率高等），且对背景依赖大，一般ES细胞的品系背景背景为F1代（如B6D2F1），嵌合用囊胚的背景为F2代（B6D2F1*B6D2F1）；
（2）8-cell胚胎注射，将ES细胞注射到8-cell阶段胚胎的透明带下，然后将嵌合胚胎移植到代孕受体的输卵管中，该方法获得嵌合鼠的嵌合比例高，其中部分仔鼠嵌合率高于90%，即一步可以获得ES小鼠。囊胚注射和8-cell注射，均可以用斜口吊尖针或者激光破膜仪（xyclone）辅助的平口针制作。影响嵌合效率的一个关键因素，是ES细胞的质量，近年有文献研究表明，在8-cell阶段的胚胎，注射1个ES细胞即可获得种系传递的ES小鼠。因而，要尽量选择已经证明具有高效嵌合和种系传递能力的细胞系。
《小鼠胚胎操作指南》（Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual）是小鼠实验的圣经，若专业从事显微注射工作，建议多读几遍，会对精通该技术起到事半功倍的效果。这里简介一下要点：
（1）超排，不同品系大小鼠的超排方案存在差异，一般小鼠激素是5IU；大鼠是30IU。时间根据当地的特点、季节等因素微调，小鼠P13:00~14:00；H11：00~12:00(间隔46~47h)；大鼠P11:00~13:00；H11:00~14:00(间隔48~49h)。
（2）公鼠每周使用1~2次；要记录挑选好的公鼠，淘汰不好用的公鼠。代孕雌鼠一旦不发情、过胖或消瘦，立即淘汰。要区别真正的栓plug与milk的区别，只选择硬的明显凝固的plug的代孕鼠。输卵管移植时，选择膨大部明显的进行移植。
（3）质粒DNA，BAC和RNA等，使用的浓度与片段大小相关，按照文献建议的要求进行；也可以在注射时，设立不同的浓度梯度。遇到太黏堵针，常用的处理方法有三种：离心（大片段BAC 3000转离心后4℃保存；小片段2万转离心后4℃保存）；过滤；重新准备。
辅助生殖技术是确保模型小鼠满足CRO、科研和生产需要的基本技术，可以解决小鼠准备和扩繁过程中遇到的各种问题。辅助生殖技术在大小鼠模型领域的应用主要包括：快速扩繁、胚胎移植、胚胎净化、精子冷冻等。bob可以提供原核注射，囊胚注射，输卵管移植，子宫移植和其他各种显微手术。
对于显微注射服务，可以按照客户要求，进行不同品系、不同阶段和不同剂量（或数量）的注射，也可以进行特定细胞，病毒，染料或其他体育材料的注射服务。同时，也可以开展各种显微手术和解剖服务。
